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中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测中国专家共识

时间: 2016-12-31 【打印页面】 【关闭窗口
 

中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体

基因突变检测专家组

一、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变检测的临床意义

EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶,该区域的激活即磷酸化对癌细胞增殖、生长的相关信号传递具有重要意义。因此,EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注,并陆续开发出了吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)和抗EGFR抗体等。

大量研究结果显示,EGFR基因突变状态是决定EGFR-TKI疗效最重要的预测因子。而EGFR基因突变的发生率在女性、非吸烟者、腺癌、亚裔人群中发生频率较高。EGFR基因突变的发生率虽然在腺癌中较高,但在未分化腺癌、腺鳞癌、小细胞癌(尤其是与腺癌的复合型)等患者中也经常可以检测到EGFR基因的突变。

在一线治疗的非小细胞肺癌患者中检测EGFR基因的突变状态具有重要的临床意义,是决定患者是否能够应用EGFR-TKI治疗的先决条件。有鉴于此,日本、欧盟的权威学术机构都已经组织专家制定了各自EGFR检测的专家共识,但是我国目前仍然没有一个规范化的检测标准或指南,因此,我们希望通过本专家共识的制定,能够规范我国EGFR基因突变的检测,力求检测结果准确。

二、EGFR基因突变检测的一般原则

在进行EGFR基因突变常规检测时,需要临床医师与病理医师协作与配合,提高临床医师“肿瘤组织需要做常规的EGFR基因突变检测”的意识。这样可以使具有EGFR基因敏感突变的患者尽可能从EGFR-TKI的治疗中受益。

1.哪些患者应接受EGFR基因突变检测?在未经选择的中国非小细胞肺癌患者中,EGFR基因的突变率约为30%。为使患者尽可能地从最有效的治疗中受益,所有非小细胞肺癌患者,只要条件许可,都应当尝试进行肿瘤组织的EGFR基因突变检测。然而,根据已知的流行病学数据,不同人群中的突变率有较大差别。以病理类型而言,腺癌患者的突变率(42.5%)大大高于非腺癌(9.5%)。以吸烟史而言,非吸烟的患者的突变率也高于吸烟患者,即使有吸烟史的腺癌患者突变率也达到30%,因此对于肺腺癌患者更应当优先考虑进行EGFR基因突变检测。

2.进行EGFR基因突变检测实验室的基本要求。EGFR基因突变检测的实施必须在有质量保证的场所,有接受过培训的技能熟练的工作人员,且必须符合中国卫生管理机构和国际的质量标准,严格避免检测过程中的污染。

3EGFR基因突变检测过程所需的时间。对于非小细胞肺癌患者的治疗策略,EGFR基因突变检测所需的时间是一个关键的因素。临床主管医师需要尽快获得检测结果。肿瘤活检及手术切除组织标本的采取及转送至病理科应尽可能在1 h以内,活检组织标本病理报告(除了免疫组织化学检测结果)应当在3个工作日内完成,手术切除标本病理报告(除了免疫组织化学检测结果)应当在5个工作日内完成。EGFR基因突变检测应在57个工作日内完成。建议从采样到获得最终的结果总过程不超过10个工作日。

三、EGFR基因突变检测标本及其处理

(一)标本的类型

肿瘤部位的新鲜组织、活检组织、手术切除标本和细胞学标本均可用于EGFR基因突变检测。因细胞学标本中肿瘤细胞数量一般较少,需应用灵敏度高的检测方法,并限于在有条件的实验室进行检测。血液标本的检测目前还处于研究阶段,建议暂不作为常规检测项目。

(二)标本的质量控制

无论采用哪种标本进行检测,均需保证达到以下的质量标准:

1.标本的固定:推荐应用4%中性缓冲的甲醛进行活检和手术切除标本的固定,避免使用Bouin液等含重金属离子的固定液。活检组织标本一般固定612 h,手术切除标本需固定648 h

2.组织切片:无论采用哪种标本类型,均应保证包含有至少200400个肿瘤细胞,尽量剔除非肿瘤组织和细胞,应用灵敏度高的方法时可酌情降低。一般需切510μm的切片10张以满足对肿瘤细胞数量的要求,切片时要有措施避免不同病例组织间的交叉污染。

上述标本的质量控制应由有经验的病理医师负责。

四、EGFR基因突变检测常用方法

(一)最佳的DNA提取方法

DNA的提取有很多方法。当组织样本较少时。推荐使用简单的吸附柱提取法,如基因组DNA提取试剂盒QIAamp DNA Mini KitQiagen公司,德国);当组织比较多时,可以采用针对甲醛固定石蜡包埋组织的DNA提取法,如QIAamp DNA FFPE Tissue KitQiagen公司,德国)。只有DNA模板的聚合酶链反应产物量足够时才能进行基因突变检测。众所周知,DNA模板的质量比数量更重要。为了提高检测成功率,建议对提取的DNA模板进行质量检测,以确定其符合一定的质量标准,质量检测的结果应当报告给临床医师。如果一个DNA标本不符合质量检测的标准,但是标准的EGFR基因突变检测的结果是阳性的,该结果也可以报告给临床医师。如果一个DNA标本不符合质量检测标准,且EGFR基因突变检测的结果是阴性的,应报告为“未发现有突变,但由于标本的质量差并不能排除突变的可能”。

(二)EGFR基因突变检测技术

目前有很多EGFR基因突变检测的方法,包括直接测序法、基于即时PCR基础上的方法(如突变扩增阻滞系统)、片段长度分析、变性高效液相色谱技术等。这些方法各有优势和劣势,目前对于哪种方法更具优势尚未达成共识。DNA

测序法应用较广,它可以检测所有的突变,但通常比较费时。基于即时PCR基础上的方法(如ARMS法)较直接测序法灵敏,但是只能检测已知突变。

不管使用何种方法。如果DNA模板量较少时,应当先检测最常见的突变(外显子1921)。

1.直接测序法:直接测序法是最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法,也是目前广泛应用的EGFR基因突变检测法。其基本原理是双脱氧链末端终止法,以纯化的PCR产物为模板,测序引物、4种脱氧核糖核苷三磷酸和标记的4种双脱氧核苷三磷酸为主要原料。在DNA聚合酶的作用下进行测序反应,当双脱氧碱基掺人链端时,该链反应就停止延长,因此通过测序反应产生一系列长度相差为一个碱基的核酸片段,这些片段可用变性聚丙烯凝胶电泳或毛细管电泳进行序列分析。目前以毛细管电泳为核心技术的全自动遗传分析仪已取代传统的聚丙烯酰胺凝胶平板电泳,灌胶、进样、数据收集分析等操作全部实现自动化,并可方便读出待测DNA序列。由于直接测序法灵敏度相对较低。同时肿瘤组织具有异质性,突变型肿瘤细胞与野生型细胞掺杂在一起,当突变DNA比例小时直接测序法可能不能敏感地检出突变,另外,由于实验过程中涉及PCR产物的多次开管操作,需特别注意防止交叉污染。

2.基于即时PCR基础上的方法(如ARMS法):2008年《新英格兰医学杂志》报道用ARMS法检测EGFR突变。该方法利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大,与此同时,利用探针对扩增产物进行检测,在即时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测,以达到对突变检测的高特异性和高灵敏度。该法检测灵敏度比直接测序有所提高,可检测样品中1.0%~0.1%的突变基因。该方法在设计上可以最大限度地缩短目标产物的长度,可以避免石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点。该方法结合即时PCR平台实现扩增时闭管操作,操作简单,无需产物的后处理,极大程度地避免了扩增产物的污染,易于在临床样品检测开展。

(三)检测结果的重复验证

如果发现了新的突变.应当重复进行检测。当测序结果差(使用测序法)时,或者循环阈值接近定义的下限值(使用ARMS法),或者不符合其他的质量标准时,也应当重复进行检测。如果检测失败,可以采取以下措施:从新的组织切片中提取DNA;重新测序或ARMS检测;用不同的样品重复检测;与病理医师讨论其他的措施。在重复检测时,最好从组织采样重新开始,复杂的样品可以和主管的临床医师一起讨论。

五、EGFR基因突变检测报告内容

EGFR基因突变检测报告应该由有资质的病理科医师提交。检测报告应包括以下内容:所检测组织的情况、标本来源、活检方法、标本大小和质量、用于提取DNA的标本中肿瘤组织的含量、检测方法、存在及不存在的各种突变类型。新发现的突变应与Greek等突变数据库进行核对。为便于临床应用,应当相应地列出新的或者少见的突变。其他相关的意见也应当记录下来以更好地解释检测结果。比如:检测的分析方法的敏感性(抽提的组织中肿瘤细胞的比重)、突变的定量分析数据等。

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